亚历山大大帝死时还不满33岁，他的死留下的最大谜团是死因。他死前最后的日子：“5月29日他因发烧睡在浴室中。翌日沐浴后进入寝宫，与米迪厄斯整日玩骰子。晚间沐浴，献祭神明，进餐，整夜烧未退。
5月31日依例再沐浴、献祭，躺于浴室中之际，听尼尔朱斯讲述航行大海探险经历取乐。6月1日烧得益发厉害：他整夜难安，次日整日高烧。他命人将床移至大浴池旁，躺在床上与诸将领讨论军中空缺及如何挑选补足。
6月4日病况更为恶化，须由人抬至户外进行献祭。之后他命高级将领在宫廷院内待命，命亲兵指挥官夜宿寝宫外。
6月5日他被移至幼发拉底河对岸的王宫中，略睡一下，但高烧不退。当将领们进到宫中，他已不能言语，直到6月6日均是如此。马其顿军此刻相信他已离开人世，齐涌向各宫门，他们开始鼓噪并威胁禁卫军，禁卫军无奈，放他们进来。门扉推开处，他们列队鱼贯缓缓走过他床边，未着披风，亦未穿甲胄。”
众说纷纭
中毒说
当时（普鲁塔克说）无人怀疑他是遭人下毒而死，但有一说谓5年后出现一些讯息，其母奥林匹亚丝因此处死多人，并命人将安提帕特之子（斟酒官）艾欧拉斯的骨灰散入风中，因推断是他下的毒。若干史学家指出，向安提帕特献计谋害国王者是亚里士多德，毒药完全乃由他所提供。
曾统治大半个已知世界的君王死后，各种传言到处流传，实不足为奇。下毒者是艾欧拉斯的说法很快就传遍雅典，雄辩家狄摩西尼提议大家表决向艾欧拉斯致谢。有些传到当代但极缺乏佐证的故事，或可支持亚历山大和赫菲斯蒂安不是死于自然死因的说法。
有一则是说有个马其顿军官，他曾目睹哈马丹及巴比伦发生的事。到亚历山大自印度归来时，他怕自己是下一次整肃的目标，便去请教算命者，他该怎么办？算命者要他不必担心；赫菲斯蒂安和亚历山大将不久于人世。
没过几天赫菲斯蒂安果然死了，一年内亚历山大也撒手人寰，两人均在饮下纯酒之后，死于原因不明的高烧。（有位医师自药理学角度提出看法，认为慢性番木鳖碱中毒是最可能的解释。无论是否事出巧合，亚里士多德的弟子兼友人植物学家锡奥夫拉斯特斯，曾提及此物的用途及剂量，并说“掩盖其苦味之上策，即使用于纯酒中”。）
后来也有些说法，说是亚里士多德自己动的手，因为他发现自己协助制造了一个祸害，但普鲁塔克最多只肯说：“最初亚历山大对亚里士多德评价极高，敬爱他超过其父……但最后几年渐渐对他产生怀疑。
他从未实际害过他，但其友谊已丧失原有的尊敬与喜爱，显见两人已渐行疏远。”与许多有关亚历山大的事迹一样，我们永远无法得知真相如何。
因酗酒和因中毒造成的肝衰竭，症状当然有相似之处。当代多数的学者否定中毒的说法，但也有人不排除亚历山大和赫菲斯蒂安是被毒死的。一群感到幻灭而愤怒的高级军官，密谋毒死亚历山大并不是不可能。
他的许多昔日好友及亲信，如今因亲眼的见闻、奢糜作风、动辄杀人的暴怒，以及也许是最糟糕的自封为神，而感到胆寒。他们觉得他已变成暴君、为所欲为、喜怒无常。亚历山大的老师亚里士多德自己就说过：“无人可自由地忍受如此统治。”
激光照射说
亚历山大大帝的死引起世人的瞩目。许多人收集资料，调查分析，认为他的真正死因是：长期受激光的照射。
两千多年前，是谁掌握了激光技术，并且还能用来杀人呢？说起来让人难以置信。
原来，亚历山大占领波斯的一座城市后，城中的贵族向他贡献了一顶王冠。王冠上镶嵌着一颗特大的，发出紫色幽光的红宝石。亚历山大戴着它，到处炫耀自己的威严和权力。
科学家发现，红宝石在太阳光的照射下发出一种特殊的自然激光。由于亚历山大长期戴着这顶镶嵌红宝石的金王冠，所以成了自然激光的牺牲品。
